Línea celular moc2

Línea celular moc2

Protocolos de cultivo de tejidos de laboratorio de Uppaluri para líneas celulares MOCActualizado 12.12.16

Materiales necesarios (ver protocolo IMDM adjunto para los reactivos necesarios para fabricar medios de línea IMDM MOC)

Sigma Aldrich: DMSO: D2650-100ml

FisherCientífico:

T150 frascos : 07-200-64

T75 Matraces : 10-126-37

Crioviales : 03-374-059

Filtros 45um: 09-754-21

05% Tripsina: sh30236.01

25% Tripsina: sh30042.01

Líneas Indolent – MOC1, 22

Líneas agresivas – MOC2

Líneas celulares de descongelación

1. Añadir 21ml de medios de línea IMDM MOC a un T150 antes de descongelar (o 10ml a un T75 si desea descongelar en aT75)

2. Retira el criovial del nitrógeno líquido, el frasco de rociado con el 70% de alcohol para limpiarlo.

3. Mantenga la mitad inferior del criovial en 37Cwaterbath (sin dejar que la tapa toque el agua, para evitar la contaminación) hasta que haya un pequeño trozo de hielo flotante.

4. Pulverice el criovial de nuevo con ETOH y coloque en la capucha. Pipeta 1 ml de medio al 1 ml de células y añade estos 2 ml al T150 que ya contiene medio (para hacer un total de 22 ml para un T150).

5. Tome algunos medios ya en el matraz T150 y enjuague la placa criovialand esto para asegurarse de que tiene todas las células residuales que quedan en la criovial.

Líneas celulares congeladas:

Trabaja rápidamente, ya que el DMSO es tóxico para las células

Para cada matraz T150 con confluencia celular del 70-80%, congelar 3-4 viales.

1. Células de cosecha de T150 como se ve a continuación

2. Girar hacia abajo en pellet en tubo cónico de 15 ml (1000 RPM x5 min)

3. Descargar sobrenadante

4. Toque el tubo cónico de 15 ml para suspender las células

5. Añadir 1,5 ml de medios de línea IMDM MOC, reconstituir células en medios – mantener en hielo

6. Añadir 1,5 ml de medio de congelación gota a gota lentamente mientras el tubo está sobre hielo

Para hacer medios de congelación – 20% DMSO en medios de línea IMDM MOC. Ejemplo: Para 20 ml de stock - agregar 16 ml de IMDM MOC medio de línea y 4 ml de DMSO. Filtro de jeringa usando filtro .45um

7. Alícuota de 1 ml cada uno a 3 crioviales

8. Almacene en -80C por no más de 2 semanas.

9. Coloque en nitrógeno líquido dentro de 1-2 semanas.

Nota: Si se desea, puede aumentar a 2 ml de IMDM y 2 ml de medio de congelación para almacenar en 4 viales. Además, es buena idea contar células y registrar en el vial antes de congelar las células.

Línea celular moc2

Características de la línea celular:

Indolente - MOC1: menos agresivo basado en estudios in vivo. Si pasa 1:12 del 80% de confluencia T150, tarda 2-4 días en alcanzar el 80% de confluencia. Las líneas celulares MOC1 tardan más en salir del matraz cuando se cosechan en comparación con las líneas celulares más agresivas.

Agresivo - MOC2: más agresivo basado en estudios in vivo. Si pasa 1:12 del 80% confluente

T150, tarda 2-4 días en alcanzar el 80% de confluencia. Las líneas celulares agresivas salen del matraz mucho más fácilmente en comparación con las líneas indolentes.

Recolección y paso de células de T150, 80% de confluencia:

1. Verter los medios de T150 en el matraz de vertido

2. Lavar una vez con 10-20 ml de PBS. Verter el lavado con PBS.

3. Añadir 1,5 ml de tripsina al 0,05%, matraz de punta para asegurarse de que la tripsina cubre toda la superficie y, por lo tanto, toca todas las células (hazlo rápidamente para que las células no estén expuestas a la tripsina por demasiado tiempo), vertir la tripsina, luego reaplicar otro 1,5 ml de tripsina al 0,25%.

4. Coloque en incubadora 37C. Incubar durante 3-4 minutos para líneas celulares agresivas y podría tomar hasta 10-12 min para indolente pero comprobar después de 6-8 min.

5. Toque el lado del matraz contra la palma de la mano deliberadamente varias veces para aflojar las células

6. Compruebe bajo el microscopio para ver si las células están flotando libremente en los medios. Si la mayoría no lo son, coloque de nuevo en la incubadora 37C durante 3-5 minutos más. Intente no dejar que las células se queden en tripsina por demasiado tiempo, ya que esto matará a las células.

Una vez que todas o la mayoría de las células están flotando, añadir 10 ml de medio de línea IMDM MOC para neutralizar la reacción.

8. Pipeta el medio y las células del matraz en una célula cónica de 15 ml a las células de pellets. Centrifugar a 1000 RPM x 5 min.

9. Verter el sobrenadante.

10. Pasar células a 1:12 - resuspendir células en otros 12 ml de medio.

11. Tome 1 ml de esto y coloque en un nuevo matraz T150 con un volumen total de 22 ml de medio de línea IMDM MOC (dilución 1:12)

12. Coloque de nuevo en la incubadora 37C para crecer. Debe alcanzar el 80% de confluencia en 2-4 días.

Inyección en flanco de ratones (heterotópico):

La concentración celular necesaria:

MOC1, MOC22: (inyectar células 1e6 en 0,15 ml) = 6,66e6 células/ml MOC2: (inyectar células 1e5 en 0,15 ml) = 6,66e5 células/ml

1. Recoger células con tripsina al 0,25% como se ha indicado anteriormente.

2. Después de neutralizar la tripsina con medios de línea IMDM MOC, girar hacia abajo la célula en pellet (1000 RPM x 5 min) en 50 ml cónicos. (Nota: use 50ml cónico para permitir que la aguja de calibre pequeño dibuje las células para

inyección.

3. Lavar las células resuspendiendo el gránulo celular en 10 ml de PBS frío con hielo (asegurándose de eliminar tanto medio que contenga FCS como sea posible), girar la célula hacia abajo en el gránulo de nuevo (1000 RPM x 5 min)

4. Lavar las células nuevamente mediante la resuspendencia de los gránulos celulares en 3-6 ml de PBS frío con hielo (el volumen se determina por el tamaño del gránulo, ya que usará este volumen para contar las células)

5. Cuenta cellsperml usando hemocitometro o contador de células automatizado, usando azul tripano para

eliminar las células muertas. Utilizando el número total de células presentes (células/ml x ml total de PBS), calcular el volumen necesario para suspender el sedimento celular para lograr una concentración de 6,66e6 (MOC1, MOC22) o 6,66e5 células/ml (MOC2).

Ejemplo, para MOC1, el recuento de células es: 2,8e6 células/ml x 5 ml (PBS) = 14e6 células totales. Células 14e6 / célula 6,66e6/ml = 2,1 ml de PBS para suspender el sedimento celular.

6. Gire las células hacia abajo en pellet de nuevo. Verter el sobrenadante de PBS (sin aspiración con pipeta). Resuspender el pellet en el volumen calculado de PBS frío con hielo necesario para alcanzar el apropiado

concentración, teniendo en cuenta que quedarán ~ 200 ul en el cónico de 50 ml después de verter el sobrenadante.

7. Transferir 50 ml cónicos en hielo e inyectar 0,15 ml (150 ul) de células por ratón en el flanco subcutáneo.

8. Inyectar ratones por protocolo estándar. Usamos una jeringa de 1 ml. Preparamos células usando una aguja de calibre 21 de 1,5 pulgadas y cambiamos la aguja a una aguja de calibre 26 de ½ pulgadas para inyectar.

Protocolo para medios 1L