Kit humano para la detección rápida de Caspasa 8 (caspasa 8)

Detección rápida Kit humano de Caspasa 8
Introducción
La Caspasa 8 es una proteína Caspasa codificada por el gen casp8. Puede actuar sobre la Caspasa - 3. Los homólogos del casp8 se han encontrado en muchos mamíferos con datos genómicos completos. El Gen casp8 codifica a un miembro de la familia de la proteasa del ácido aspártico (caspasa). Esta proteína participa en la muerte celular programada inducida por FAS y varios estimulantes apoptóticos. El dominio de efecto de muerte similar a fadd en el extremo n de esta proteína sugiere que puede interactuar con la proteína FAS fadd. La inmunodeterminación humana Caspasa 8 de este Kit es un sandwich de fase sólida de tres pasos para medir la Caspasa 8 humana en el sobrenadante de cultivo celular, suero y plasma. El kit contiene E. Coli que expresa caspase8 humana recombinante y anticuerpos producidos contra proteínas recombinantes. Los resultados obtenidos con caspase8 natural muestran una curva lineal paralela a la obtenida con el estándar recombinante. Estos resultados sugieren que el kit se puede utilizar para determinar el valor de masa relativa de caspase8 en personas naturales.

Principio de detección

El kit utiliza el método de sándwich de doble anticuerpoTécnica elisa: el paquete de anticuerpos capturados se coloca en la placa estándar de la enzima, se captura la Caspasa 8 en la muestra y el estándar, después de la incubación y limpieza, se añade el anticuerpo de detección marcado para la incubación y limpieza, formando un complejo inmunológico de "anticuerpos capturados - antígenos - anticuerpos de detección", y luego se añade la capsídica de rábano picante acoplada a la estreptomicina para la incubación, que se limpia después de la incubación, y luego se añade el líquido de color tmb, si el objeto de detección en la muestra es azul, se añade el líquido de terminación para detener la reacción. Los componentes libres durante la prueba fueron lavados y los valores de od se midieron a 450 nm con un medidor de enzima, la profundidad del color fue proporcional al contenido de la muestra a medir, y la concentración de caspase8 en la muestra se calculó dibujando la curva estándar.

Puntos clave de la operación

1. al mezclar soluciones proteicas, siempre se debe evitar la ampollas. Para evitar la contaminación cruzada, la cabeza de la pipeta debe cambiarse al agregar cada estándar, muestra y reactivo. Además, cada reactivo debe utilizar un recipiente separado.

2. asegúrese de que el reactivo se agregue ininterrumpidamente al agujero de la placa. Para garantizar resultados precisos, es necesario pegar la película de sellado en el paso de incubación.

3. cuando se utiliza una lavadora automática de placas, se puede mejorar la precisión de la determinación añadiendo un período de inmersión de 30 segundos después de agregar el amortiguador de lavado, o girando la placa 180 grados entre los pasos de lavado.

4. el agente de color debe mantenerse incoloro hasta que se agregue a la placa. Asegúrese de que el desarrollador de color no esté expuesto a la luz. El agente de color debe cambiar de incoloro a Azul.

5. el líquido de terminación debe añadirse a la placa en el mismo orden que el agente de color. Después de agregar el líquido de terminación, el color formado en el agujero cambiará de azul a amarillo. El agujero Verde indica que la solución de terminación no se mezcla completamente con la solución de matriz.

Otros materiales necesarios

1. El medidor de estándar enzimático incluye una longitud de onda de determinación de 450 nm, mientras que la longitud de onda de corrección de 600 - 680 nm es mejor;

2. pipeta y cabeza de pistola;

3. agua destilada o desionizada;

4. cilindro graduado de 100 - 1000 ml;

5. lavar botellas, descargar pistolas o máquinas automáticas de limpieza de microporos;

6. osciladores de placa microporosa de órbita horizontal, capaces de mantener una velocidad de 500 ± 50 rpm;

7. tubos de ensayo para diluir estándares y muestras.

Detección rápida CistinaKit humano 8 (caspase8)
Precauciones

1. el líquido de terminación proporcionado por este Kit es una solución de ácido sulfúrico diluido, que tiene cierta corrosividad y debe operarse con precaución.

2. algunos ingredientes de este Kit contienen conservantes que pueden causar reacciones alérgicas en la piel, y se debe usar una máscara para evitar la inhalación de niebla.

3. el agente de color B puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias, y se debe usar una máscara para evitar la inhalación de niebla.

4. use guantes protectores, artículos de protección ocular y facial y Lávese las manos después de procesarlos.

Preparación del reactivo

1. mantenga todos los reactivos a temperatura ambiente durante unos 30 minutos antes de usarlos.

2. configuración del detergente / diluyente: si el detergente / diluyente (20 ×) tiene precipitación cristalina, es necesario calentar todos los cristales a 37 ° C para disolverlos. Diluir con agua destilada 1: 20 (por ejemplo: 1 ml de detergente concentrado a 19 ml de agua destilada)

Configuración estándar

Extraer el estándar del kit y prepararse7 tubos de ensayo, primero de400 ng / mlProductos estándar..200 μl) absorber una cierta cantidad de diluyente de 1 × 1 a 20ng / ML según sea necesario (ejemplo: 50 μl de líquido madre estándar + 950 μl de diluyente de 1 × 1 para preparar 1000 μl de estándar de concentración de 20ng / ml), y luego agregar 500 μl de diluyente de 1 × 1 en seis tubos de ensayo, en Los que el estándar de 20ng / ML se diluye dos veces a seis gradientes a su vez, para preparar un total de siete concentraciones de estándar, a su vez:20% / ml, 10% / ml, 5% / ml, 2,5 ng / ml, 1,25 ng / ml, 0625 ng / ml,Extraer de la solución estándar de concentraciónEl estándar de 500 μl se va al siguiente tubo de ensayo, se sopla suavemente y se mezcla bien, y así sucesivamente para la dilución de doble relación del estándar (como se muestra en la imagen), y el diluyente de 1 × se utiliza como estándar de concentración cero (0ng / ml)

Cálculo de los resultados

Calcular el promedio de los agujeros compuestos de los estándares y muestrasEl valor de od y restar el valor de od del agujero en blanco como valor de corrección. Con la concentración como coordenada horizontal y el valor de od como coordenada vertical, dibuja la curva estándar de la función lógica de cuatro parámetros en el papel de coordenada (el valor que elimina el Grupo en blanco al dibujar) o utiliza un software informático capaz de generar el ajuste de la curva de la lógica de cuatro parámetros (4 - p) para crear La curva estándar. Si el valor de od de la muestra está por encima del límite superior de la curva estándar, se debe volver a medir después de la dilución adecuada y multiplicar por el múltiplo de dilución correspondiente al calcular la concentración de la muestra..

Datos de ejemplo

Los siguientes datos y curvas son solo para referencia, y el experimentador debe establecer una curva estándar basada en sus propios datos experimentales.

La curva estándar mostrada en este gráfico es solo un ejemplo, y el cálculo de los resultados debe basarse en la curva estándar dibujada por el mismo estándar de prueba.
Sensibilidad

Después de la prueba de la muestra, la sensibilidad de detección de este Kit esde 0,16 ng/ml.

Especificidad

Este Kit determina que se pueden identificar personas naturales y recombinantesCaspase8.

Otras proteínas relacionadas se preparan en el tampón de dilución como50ng/mL， Y se determina la reactividad cruzada. No se observaron reacciones cruzadas obvias.

Resumen de los pasos experimentales
1. agregue productos y muestras estándar, reaccione a 37 ° C para evitar la luz 1,5h y lave tres veces.

2. Añadir anticuerpos de detección,37 ° C para evitar la reacción de la luz durante 1 hora, lavar 4 veces.

3. Unión enzimática añadida,37 ° C para evitar la reacción de la luz durante 30 minutos, lavar 4 veces.

4. agregue una solución de color y evite la luz a 37 ° C durante 15 minutos.

5. añadir líquido de terminación y leer en 5 minutos

personaCistina8(Caspase8)El kit se utiliza para la detección cuantitativa de personas en el sobrenadante de cultivo celular, suero y plasma.Caspase8Antes de usar este producto, debe leer este prospecto completamente., personasEl kit de Elisa es solo para investigación científica y no puede usarse en otros diagnósticos..