Kit humano de colágeno Tipo IV Alfa 1 (col4 alfa 1) ml105 965

Kit humano de colágeno Tipo IV Alfa 1 (col4 alfa 1) ml105 965
Introducción
El Colágeno Tipo IV Alfa 1 (col4a1) es una proteína codificada por el gen col4a1 en el cromosoma 13. Pertenece a la familia de colágeno Tipo IV y contiene tres dominios: un dominio corto de extremo n, un dominio largo de triple hélice 7s ubicado en su centro y un dominio no colágeno 1 (nc1) ubicado en su extremo c. Se expresa universalmente en muchos tipos de tejidos y células. Col4a1 es una subunidad del Colágeno Tipo IV que actúa en la angiogénesis. Las mutaciones en este gen se asocian con enfermedades del cerebro, los músculos, los riñones, los ojos y el sistema cardiovascular. La inmunodeterminación humana col4alfa 1 de este Kit es un Elisa sandwich de fase sólida de tres pasos para medir la col4alfa 1 humana en el sobrenadante de cultivo celular, suero y plasma. El kit contiene E. Coli que expresa el col4alfa 1 humano recombinante y anticuerpos producidos contra proteínas recombinantes. Los resultados obtenidos con el humano natural col4alfa 1 muestran una curva lineal paralela a la curva estándar obtenida con el estándar recombinante. Estos resultados sugieren que el kit se puede utilizar para determinar el valor de masa relativa de col4alpha 1 en personas naturales.

Principio de detección

El kit utiliza el método de sándwich de doble anticuerpoTecnología elisa: el paquete de anticuerpos capturados se coloca en la placa estándar de la enzima, se captura el objeto a detectar en la muestra y el objeto estándar col4alpha 1, después de la incubación y limpieza, se añade el anticuerpo de detección marcado para la incubación y limpieza, formando un complejo inmunológico de "anticuerpo de captura - antígeno - anticuerpo de detección", y Luego se añade la enzima de rábano picante acoplada a la estreptomicina para la incubación, que se limpia después de la incubación, y luego se añade el líquido de color tmb, si el objeto a detectar en la muestra es azul, se añade el líquido de terminación para detener la reacción. Los componentes libres durante la prueba fueron lavados y el valor de od se midió a 450 nm con un medidor de enzima, la profundidad del color fue proporcional al contenido de los objetos a medir en la muestra, y la concentración de col4alfa 1 en la muestra se calculó dibujando la curva estándar.

Puntos clave de la operación

1. al mezclar soluciones proteicas, siempre se debe evitar la ampollas. Para evitar la contaminación cruzada, la cabeza de la pipeta debe cambiarse al agregar cada estándar, muestra y reactivo. Además, cada reactivo debe utilizar un recipiente separado.

2. asegúrese de que el reactivo se agregue ininterrumpidamente al agujero de la placa. Para garantizar resultados precisos, es necesario pegar la película de sellado en el paso de incubación.

3. cuando se utiliza una lavadora automática de placas, se puede mejorar la precisión de la determinación añadiendo un período de inmersión de 30 segundos después de agregar el amortiguador de lavado, o girando la placa 180 grados entre los pasos de lavado.

4. el agente de color debe mantenerse incoloro hasta que se agregue a la placa. Asegúrese de que el desarrollador de color no esté expuesto a la luz. El agente de color debe cambiar de incoloro a Azul.

5. el líquido de terminación debe añadirse a la placa en el mismo orden que el agente de color. Después de agregar el líquido de terminación, el color formado en el agujero cambiará de azul a amarillo. El agujero Verde indica que la solución de terminación no se mezcla completamente con la solución de matriz.

Otros materiales necesarios

1. El medidor de estándar enzimático incluye una longitud de onda de determinación de 450 nm, mientras que la longitud de onda de corrección de 600 - 680 nm es mejor;

2. pipeta y cabeza de pistola;

3. agua destilada o desionizada;

4. cilindro graduado de 100 - 1000 ml;

5. lavar botellas, descargar pistolas o máquinas automáticas de limpieza de microporos;

6. osciladores de placa microporosa de órbita horizontal, capaces de mantener una velocidad de 500 ± 50 rpm;

7. tubos de ensayo para diluir estándares y muestras.

Kit humano de colágeno Tipo IV Alfa 1 (col4 alfa 1) ml105 965
Precauciones

1. el líquido de terminación proporcionado por este Kit es una solución de ácido sulfúrico diluido, que tiene cierta corrosividad y debe operarse con precaución.

2. algunos ingredientes de este Kit contienen conservantes que pueden causar reacciones alérgicas en la piel, y se debe usar una máscara para evitar la inhalación de niebla.

3. el agente de color B puede causar irritación de la piel, los ojos y las vías respiratorias, y se debe usar una máscara para evitar la inhalación de niebla.

4. use guantes protectores, artículos de protección ocular y facial y Lávese las manos después de procesarlos.

Preparación del reactivo

1. mantenga todos los reactivos a temperatura ambiente durante unos 30 minutos antes de usarlos.

2. configuración del detergente / diluyente: si el detergente / diluyente (20 ×) tiene precipitación cristalina, es necesario calentar todos los cristales a 37 ° C para disolverlos. Diluir con agua destilada 1: 20 (por ejemplo: 1 ml de detergente concentrado a 19 ml de agua destilada)

Configuración estándar

Extraer el estándar del kit y prepararse7 tubos de ensayo, primero de1 μg / mlProductos estándar..200 μl) absorber una cierta cantidad de diluyente de 1 × 1 a 50 ng / ML según sea necesario (ejemplo: 50 μl de líquido madre estándar + 950 μl de diluyente de 1 × 1 para preparar 1000 μl de estándar de concentración de 50 ng / ml), y luego añadir 500 μl de diluyente de 1 × 1 en seis tubos de ensayo, en los que el estándar de 50 ng / ML se diluye dos veces a seis gradientes a su vez, para preparar un total de siete concentraciones de estándar, a su vez:50% de / ml, 25% de / ml, 12,5% de / ml, 6,25 ng / ml, 3125 ng / ml, 1563 ng / ml,Extraer de la solución estándar de concentraciónEl estándar de 500 μl se va al siguiente tubo de ensayo, se sopla suavemente y se mezcla bien, y así sucesivamente para la dilución de doble relación del estándar (como se muestra en la imagen), y el diluyente de 1 × se utiliza como estándar de concentración cero (0ng / ml)

Cálculo de los resultados

Calcular el promedio de los agujeros compuestos de los estándares y muestrasEl valor de od y restar el valor de od del agujero en blanco como valor de corrección. Con la concentración como coordenada horizontal y el valor de od como coordenada vertical, dibuja la curva estándar de la función lógica de cuatro parámetros en el papel de coordenada (el valor que elimina el Grupo en blanco al dibujar) o utiliza un software informático capaz de generar el ajuste de la curva de la lógica de cuatro parámetros (4 - p) para crear La curva estándar. Si el valor de od de la muestra está por encima del límite superior de la curva estándar, se debe volver a medir después de la dilución adecuada y multiplicar por el múltiplo de dilución correspondiente al calcular la concentración de la muestra..

Datos de ejemplo

Los siguientes datos y curvas son solo para referencia, y el experimentador debe establecer una curva estándar basada en sus propios datos experimentales.

La curva estándar mostrada en este gráfico es solo un ejemplo, y el cálculo de los resultados debe basarse en la curva estándar dibujada por el mismo estándar de prueba.
Sensibilidad

Después de la prueba de la muestra, la sensibilidad de detección de este Kit esde 0,39 ng/ml.

Especificidad

Este Kit determina que se pueden identificar personas naturales y recombinantesCOL4α1.

Otras proteínas relacionadas se preparan en el tampón de dilución como50ng/mL， Y se determina la reactividad cruzada. No se observaron reacciones cruzadas obvias.

Resumen de los pasos experimentales
1. agregue productos y muestras estándar, reaccione a 37 ° C para evitar la luz 1,5h y lave tres veces.

2. Añadir anticuerpos de detección,37 ° C para evitar la reacción de la luz durante 1 hora, lavar 4 veces.

3. Unión enzimática añadida,37 ° C para evitar la reacción de la luz durante 30 minutos, lavar 4 veces.

4. agregue una solución de color y evite la luz a 37 ° C durante 15 minutos.

5. añadir líquido de terminación y leer en 5 minutos

personaColágenoTipo IV Alfa 1 (col4 alfa 1)El kit se utiliza para la detección cuantitativa de personas en el sobrenadante de cultivo celular, suero y plasma.COL4α1Antes de usar este producto, debe leer este prospecto completamente., personasEl kit de Elisa es solo para investigación científica y no puede usarse en otros diagnósticos..