Especificaciones del kit de extracción y purificación de ácidos nucleicos del ARN

Ventajas características:

1.Especificidad: los primeros utilizados en todos los productos han sido analizados exhaustivamente por bioinformática, yGenBankY la comparación de una gran base de datos autoconstruida garantiza que cada primer utilizado sea un segmento de secuencia genética específico del género o serotipo, lo que puede lograr una detección específica del género bacteriano y serotipo, y la especificidad alcanzaBuena .

2. Reproducibilidad: todos los productos de la serie han sido verificados por un gran número de cepas experimentales, y la reproducibilidad esBuena .

3. Sensibilidad: esta serie de productos puede lograr una detección altamente sensible de bacterias detectadas, cuando la concentración de bacterias en la muestra alcanza103cfu/mlAl mismo tiempo, se puede realizar la detección directa de él, sin necesidad de un engorroso proceso de aumento de bacterias.

4. Practicidad: el alcance de la detección es amplio, cubriendo aquellos que son más dañinos para el cuerpo humano.17Se trata de bacterias patógenas respiratorias e intestinales que permiten una detección rápida de muestras clínicas y otras muestras ambientales.3 - 4Horas.

5. ventaja1: los recursos secuenciales son abundantes, exceptoGenBankAdemás de la secuencia publicada, la compañía también ha descifrado una gran cantidad de cepas, lo que garantiza teóricamente que los primeros seleccionados tengan una buena conservación y especificidad.

6. ventaja2: esta serie de kits ha sido verificada por un gran número de experimentos de conservación y especificidad. con los ricos recursos de bacterias de la compañía, cada kit de prueba ha sido verificado.20Verificación de la conservación de más cepas estándar y cepas clínicas y40La verificación de la especificidad de las cepas estándar cercanas y las cepas clínicas garantiza que no se produzcan resultados falsos positivos y falsos negativos en el uso.

Pasos de extracción:

1. retire la muestra del refrigerador negativo ochenta y póngala sobre hielo para descongelarla lentamente; (centrifugadora preconfriada a 4 grados con antelación)

2. después del descongelamiento (rojo), añadir 200 μl de cloroformo (1 / 5 del volumen de trizor), sacudir violentamente (rojo lechoso) y Dejar reposar sobre hielo durante 10 minutos. (el cloroformo es un disolvente orgánico que permite una rápida separación de las fases orgánicas e inorgánicas. en la fase orgánica se unen principalmente fenoles y proteínas, lo que hace que las proteínas se separen del arn, que entra en la fase acuática. (...)

3. colocar en una centrifugadora preconfriada, centrifugada (4 grados, 12000 rpm, 15 min), después de la centrifugación se puede ver claramente dividida en tres capas (la fase de agua transparente incolora superior es la capa de arn, el blanco lechoso muy delgado en el Medio es la capa de ADN y la capa inferior es la capa de proteína roja).

4. absorbe cuidadosamente y lentamente el líquido superior, alrededor de 400 μl (es mejor aspirar menos que aspirar más), colócalo en otro nuevo tubo EP rnase - Free de 1,5 ml, agrega un volumen igual de alcohol isopropílico, mezcla al revés arriba y abajo, y deja reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

5. centrifugación (4 grados, 12000 rpm, 15 min), precipitación blanca visible (a veces las células no ven menos precipitación, se pueden colocar veinte o ochenta horas negativas antes de continuar los pasos posteriores)

6. abandone el líquido superior, agregue 950 ul 75% de etanol a cada tubo y mezcle al revés (recuerde no soplar con una pistola para mezclar bien, lo que causará la disolución del arn).

7. centrifugación (4 grados, 12000 rpm, 10 min), se puede ver una precipitación blanca obvia en la parte inferior.

8. después de la centrifugación, abandone la parte superior del líquido, Póngalo en la centrifugadora y vuelva a alejarse instantáneamente, lave el líquido residual con un pipeta de 10 μl y abra la tapa para secarlo (unos 5 minutos).

9. añadir una cantidad adecuada de agua DEPC (generalmente de 20 a 30 μl, a veces no se puede ver la precipitación, se puede disolver con 10 μl de agua depc) de acuerdo con el tamaño de la precipitación, soplar ARN disuelto, medir la concentración con el medidor enzimático del undécimo piso, marcar el valor de od (260 / 280 = 1,8 - 2,0), conservar en 80 negativos.

Nota: para la extracción de neutrófilosEl ARN recomienda un número de células superior a 2x106 / muestra;

Nota: Use una máscara durante la operación.

Cinco elementos de la respuesta pcr:
ParticipaciónHay cinco sustancias principales para la reacción pcr, a saber, primers, enzimas, dNTP、 Plantilla y mg2 +.
Primer:Los primeros son la clave de la respuesta específica de la pcr, y la especificidad de los productos PCR depende del grado en que los primeros se complementan con el ADN de la plantilla. En teoría, siempre que se conozca cualquier secuencia de ADN de plantilla, se puede diseñar una cadena de oligonucleótidos complementaria como primer, y el uso de PCR puede ampliar el ADN de plantilla en grandes cantidades in vitro.
El diseño de los primeros debe seguir los siguientes principios:
① longitud del primer: 15 - 30 bp, comúnmente alrededor de 20 bp.
② lapso de amplificación del primer: 200 - 500bp es adecuado, y el fragmento que puede ampliarse a 10kb en condiciones específicas.
③ base de primer: el contenido de G + C es del 40 - 60%, el efecto de amplificación de G + C es demasiado pequeño, y el exceso de G + C es propenso a bandas no específicas. El atgc se distribuye bien al azar y evita la disposición en cadena de más de cinco nucleótidos de Purina o pirimidina.
④ evitar la aparición de una estructura secundaria en el interior del primer y evitar la complementariedad entre los dos primeros, especialmente en el extremo 3 ', de lo contrario se formará un Dímero del primer y se producirán bandas amplificadas no específicas.
⑤ las bases en el extremo 3 'del primer, especialmente las bases finales e inferiores, deben emparejarse estrictamente para evitar el fracaso de la PCR debido al desajuste de las bases finales.
Hay o se pueden agregar sitios de restricción enzimática adecuados en los primeros, y la secuencia objetivo amplificada tiene sitios de restricción enzimática adecuados, lo que es muy bueno para el análisis de restricción enzimática o la clonación molecular.
7. especificidad del primer: el primer no debe tener Homología obvia con otras secuencias de la base de datos de secuencias de ácidos nucleicos.

Precauciones:

1. el kit debe extraerse del ambiente refrigerado y debe equilibrarse a temperatura ambiente durante 15 - 30 minutos antes de que pueda usarse. si el paquete estándar enzimático no se agota después de la apertura de la placa, la placa debe cargarse en una bolsa sellada para su conservación. El detergente concentrado puede tener precipitaciones cristalinas, que se pueden calentar y ayudar a la disolución en un baño de agua cuando se diluye, sin afectar el resultado cuando se lava.

2. el muestreador debe utilizarse en cada paso de la muestra y su precisión debe corregirse con frecuencia para evitar errores de prueba. El tiempo de muestra única se controla en 5 minutos, si el número de especímenes es grande, se recomienda usar la pistola de pelotón para agregar muestras.

3. por favor, haga la curva estándar al mismo tiempo que cada determinación，Hacer agujeros compuestos. Si el contenido de la sustancia a medir en la muestra es demasiado alto (muestraEl valor de od es mayor que el valor de od de un agujero di del agujero estándar. diluya un cierto múltiplo (n veces) con una dilución de muestra antes de determinarlo. al calcular, por favor.otra vezMultiplicado por el múltiplo de dilución total..x N x 5).

4. la película de sellado se limita al uso único para evitar la contaminación cruzada.

5. el sustrato debe conservarse protegido de la luz.

6. siga estrictamente el funcionamiento de las instrucciones, y los resultados de la prueba deben basarse en la lectura del medidor de enzima.

7. todas las muestras, detergentes y diversos residuos deben tratarse como contagios.

8. los diferentes componentes del número de lote de este reactivo no se pueden mezclar.

9. no se pueden usar productos caducados.

10. si hay diferencias con las instrucciones en inglés, prevalecerán las instrucciones en inglés.

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