I. principios de Elisa

La base de Elisa es la fase sólida de antígenos o anticuerpos y el etiquetado enzimático de antígenos o anticuerpos. Los antígenos o anticuerpos Unidos a la superficie del vector sólido mantienen su actividad inmunológica, y los antígenos o anticuerpos marcados por la enzima conservan tanto su actividad inmunológica como la actividad de la enzima. En el momento de la determinación, la muestra examinada (el anticuerpo o antígeno en el que se determina) reacciona con el antígeno o anticuerpo en la superficie del vector sólido. El complejo de antígenos y anticuerpos formado en el portador sólido se separa del resto de sustancias en el líquido mediante lavado. La adición de antígenos o anticuerpos marcados con enzimas también se une al portador sólido a través de la reacción. En este momento, la cantidad de enzima en la fase sólida es proporcional a la cantidad de sustancia examinada en la muestra. Después de agregar el sustrato de la reacción enzimática, el sustrato es catalizado por la enzima para convertirse en un producto de color, y la cantidad del producto está directamente relacionada con la cantidad de la sustancia examinada en la muestra, por lo que se puede analizar cualitativamente o cuantitativamente en función de la profundidad del color. Debido a la alta eficiencia catalítica de la enzima, el resultado de la respuesta inmune se amplifica indirectamente, lo que hace que el método de determinación alcance una alta sensibilidad.

II. tipos de Elisa

Elisa se puede utilizar para determinar antígenos o anticuerpos. Hay tres reactivos necesarios en este método de determinación: (1) el antimicrobiano o anticuerpo sólido, es decir, el 'inmunosorbente' (immunosorbent); (2) antígenos o anticuerpos marcados por enzimas, llamados' Unión '; (3) sustrato de la reacción enzimática. De acuerdo con el origen del reactivo y la situación de la muestra y las condiciones específicas de la detección, se pueden diseñar varios tipos de métodos de detección. Los principales tipos de ELISA para pruebas clínicas son los siguientes:

1. detección de antígenos por sándwich de doble anticuerpo

El método de sándwich de doble anticuerpo es un método común para detectar el antígeno zui. los pasos de operación son los siguientes:

1) conectar anticuerpos específicos con portadores sólidos para formar anticuerpos sólidos. Lavar para eliminar los anticuerpos e impurezas no Unidos.

2) añadir las muestras examinadas y la reacción de aislamiento térmico. Los antígenos de la muestra se unen a anticuerpos sólidos para formar complejos de anticuerpos de antígenos sólidos. Lavar para eliminar otras sustancias no vinculadas.

3) añadir anticuerpos estándar enzimáticos y aislar la reacción. Los antígenos del complejo inmunológico sólido se unen a los anticuerpos marcados con enzimas. * lavar los anticuerpos estándar enzimáticos no Unidos. En este momento, la cantidad de enzima en el vector de fase sólida está relacionada con la cantidad de antígeno detectado en la muestra.

4) añadir sustrato para colorear. Los sustratos catalíticos enzimáticos en la fase sólida se convierten en productos de color. A través de la comparación de colores, se mide la cantidad de antígenos en la muestra.

En los ensayos clínicos, este método es adecuado para probar antígenos macromoleculares como diversas proteínas, como hbag, hbeag, afp, hcg, etc. Siempre que se obtengan anticuerpos heterosexuales contra el antígeno examinado, este método se puede utilizar para encapsular portadores sólidos y preparar complejos enzimáticos. Por ejemplo, la fuente de los anticuerpos es el antisuero, y los anticuerpos envueltos y marcados con enzimas se toman de animales de diferentes especies y géneros, respectivamente. Si se aplican anticuerpos monoclonales, generalmente se seleccionan dos anticuerpos monoclonales dirigidos a diferentes determinantes en el antígeno, que se utilizan para encapsular vectores sólidos y preparar complejos enzimáticos. Este método de sándwich de doble sitio tiene una alta especificidad y puede aislar la muestra examinada con anticuerpos estándar enzimáticos para una prueba en un solo paso. En la determinación en un solo paso, cuando el contenido del antígeno examinado en la muestra es muy alto, el antígeno excesivo se une a anticuerpos sólidos y anticuerpos estándar enzimático, respectivamente, sin formar ya un 'complejo sándwich'. Similar al fenómeno de la banda trasera del exceso de antígenos en la reacción de precipitación, cuando el valor de absorción de luz del color después de la reacción (ubicado en la banda de exceso de antígenos) es el mismo que el valor de absorción de luz de una concentración de antígeno en la curva estándar (ubicado en la banda de exceso de anticuerpos), Si se mide de acuerdo con el método normal, el resultado será inferior al contenido real, este fenómeno se llama efecto gancho, porque la curva estándar se dobla en forma de gancho después de alcanzar el pico. Cuando el efecto de gancho es grave, la respuesta incluso puede producir resultados falsos negativos sin mostrar color. Por lo tanto, se debe prestar atención a los valores altos de Zui en el rango medible al usar reactivos de un solo paso para determinar sustancias que pueden aumentar anormalmente el contenido en la muestra (como hbag en suero, AFP y HCG en orina, etc.). La preparación de tales reactivos con anticuerpos monoclonales de alta afinidad puede debilitar el efecto de gancho. Si hay varios determinantes idénticos en los diferentes sitios de la molécula medida, como el determinante a del hbag, también se puede envolver el mismo Anticuerpo monoclonal determinado para esto en fase sólida y preparar el complejo enzimático, respectivamente. Sin embargo, se debe prestar atención al problema de los subtipos en la detección del HBS ag, que tiene cuatro subtipos adr, adw, Ayr y ayw, aunque cada subtipo tiene la misma reactividad de un determinante, que también es un problema a tener en cuenta con anticuerpos monoclonales como método de sándwich. Otra de las precauciones para la determinación de antígenos por el método de sándwich de doble anticuerpo es la interferencia del factor reumatoide (rf). El RF es un autoanticuerpo, en su mayoría tipo igm, que puede unirse a una variedad de segmentos FC de IgG animal. Si el espécimen de suero utilizado como prueba de sándwich de doble anticuerpo contiene R f, puede actuar como componente antigénico, mientras se une a anticuerpos sólidos y anticuerpos estándar enzimáticos, mostrando una respuesta falsa positiva. El reactivo que utiliza f (ab ') o fragmentos FAB como Unión enzimática elimina la interferencia de radiofrecuencia al eliminar el segmento fc. Si los reactivos de Elisa de doble sándwich de anticuerpos se ven afectados por la radiofrecuencia se ha incluido como un indicador de evaluación de este tipo de reactivos. El método de sándwich de doble anticuerpo es adecuado para la determinación de antígenos macromoleculares bivalentes o superiores, pero no para la determinación de antígenos hapten y antígenos monovalentes de moléculas pequeñas, porque no puede formar sándwich de dos sitios.

2. detección de anticuerpos por sándwich de doble antígeno

El modo de reacción es similar al método de sándwich de doble anticuerpo. El envoltorio se realiza con antígenos específicos y se prepara un complejo enzimático para detectar los anticuerpos correspondientes. La diferencia con la detección indirecta de anticuerpos es la sustitución de anticuerpos estándar enzimáticos por antígenos estándar enzimáticos. Las muestras analizadas en este método no necesitan ser diluidas y se pueden utilizar directamente para la determinación, por lo que su sensibilidad es relativamente mayor que la del método indirecto. Este método se utiliza a menudo para la detección de anti - HBS en los marcadores de hepatitis B. La clave de este método radica en la preparación de antígenos marcados con enzimas, y se deben encontrar métodos de etiquetado adecuados de acuerdo con las diferentes estructuras de antígenos.

3. detección indirecta de anticuerpos

El método indirecto es un método común para detectar anticuerpos. Su principio es utilizar anticuerpos anticuerpos marcados por enzimas (anticuerpos de inmunoglobulina humana) para detectar anticuerpos detectados que se unen a antígenos sólidos, por lo que se llama método indirecto (véase la figura 2 - 3). Los pasos de operación son los siguientes:

1) conectar antígenos específicos con portadores de fase sólida para formar antígenos de fase sólida. Lavar para eliminar antígenos e impurezas no Unidos.

2) añadir suero diluido para la prueba y aislar la reacción. Los anticuerpos específicos en el suero se unen a los antígenos sólidos para formar un complejo de anticuerpos de antígenos sólidos. Después del lavado, solo quedan anticuerpos específicos en el portador sólido, y otros componentes del suero se lavan durante el lavado.

3) añadir anticuerpos estándar enzimáticos. Se puede utilizar la enzima para etiquetar IgG humana para detectar anticuerpos totales, pero generalmente se utiliza la enzima para etiquetar IgG humana para detectar anticuerpos igg. Los anticuerpos en el complejo inmunológico sólido se unen a los anticuerpos marcados con enzimas, marcando así indirectamente la enzima. Después del lavado, la cantidad de enzima en el portador sólido está positivamente relacionada con la cantidad de anticuerpos detectados en la muestra.

4) añadir color de sustrato este método se utiliza principalmente para la detección de anticuerpos patógenos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas.

La ventaja del método indirecto es que siempre que se cambie el antígeno del paquete, se puede utilizar el mismo anticuerpo estándar enzimático para establecer un método de detección de los anticuerpos correspondientes. La clave del éxito del método indirecto radica en la pureza del antígeno. Aunque a veces se pueden obtener resultados prácticos y efectivos con el paquete de antígenos de extracción gruesa, se debe purificar en la medida de lo posible para mejorar la especificidad del ensayo. Se debe prestar especial atención a la eliminación de las impurezas que pueden reaccionar con el suero de personas sanas en general, como los antígenos recombinantes con E. coli como enzima de ingeniería, como el que contiene el componente E. coli, y es probable que reaccionen con anticuerpos anti - E. coli en el suero de personas infectadas con E. coli. Los antígenos tampoco pueden contener sustancias que respondan a la IG humana marcada por la enzima, como antígenos procedentes del plasma humano o de tejidos humanos, como no eliminar IG de ellos, y también se han producido falsos positivos en el ensayo. Además, si el antígeno contiene proteínas no relacionadas, también afectará el efecto del sobre debido a la adsorción competitiva. Otro factor de interferencia en el método indirecto es la alta concentración de no especificidad contenida en el suero normal. La IgG específica detectada en el suero del paciente representa solo una pequeña parte de la IgG total. La IgG es muy adsorbente, y la IgG no específica se puede adsorber directamente en el portador sólido y, a veces, en la superficie del antígeno envuelto. Por lo tanto, en el método indirecto, los paquetes de antígenos generalmente se envuelven de nuevo con proteínas no relacionadas (como la seroproteína bovina) para cerrar el vacío en la fase sólida. Además, durante la prueba, las muestras deben diluirse primero (1: 40 a 1: 200) para evitar que el Fondo negativo excesivo afecte el juicio del resultado.

4. método de competencia para la medición de anticuerpos

Este método se puede utilizar para detectar anticuerpos específicos cuando las sustancias interferentes en el material antigénico no son fáciles de eliminar o no son fáciles de obtener suficientes antígenos purificados. El principio es que los anticuerpos en la muestra y una cierta cantidad de anticuerpos marcados con enzimas compiten con la Unión de antígenos sólidos. Cuanto mayor sea la cantidad de anticuerpos en la muestra, menor será el anticuerpo estándar enzimático unido a la fase sólida, por lo que el color de la respuesta positiva es más claro que el negativo. Si el antígeno es de alta pureza, se puede envolver directamente en fase sólida. Si habrá sustancias interferentes en el antígeno, el recubrimiento directo no es fácil de tener éxito, se puede utilizar el método de recubrimiento de captura, es decir, primero se envuelven los anticuerpos correspondientes al antígeno de fase sólida, y luego se añaden los antígenos para formar el antígeno de fase sólida. Lavar para eliminar las impurezas en el antígeno y luego agregar la muestra y el anticuerpo estándar enzimático para la reacción de unión competitiva. El método de competencia tiene varios modos de detección de anticuerpos, que pueden combinar muestras y anticuerpos marcados con enzimas con la competencia de antígenos sólidos, y el método anti - HBc Elisa generalmente se utiliza. Otro patrón es agregar el espécimen al anticuerpo sólido junto con el antígeno para la Unión competitiva, y luego agregar el anticuerpo estándar enzimático después del lavado para reaccionar con el antígeno unido al sólido. Este método se utiliza generalmente para la detección antihbe.

5. método de competencia para la determinación de antígenos

Los antígenos de moléculas pequeñas o semianticuerpos carecen de más de dos sitios que puedan utilizarse como método de sándwich, por lo que no se pueden determinar con el método de sándwich de doble anticuerpo y se puede utilizar el modo de método competitivo. El principio es que los antígenos en la muestra y una cierta cantidad de antígenos marcados con enzimas compiten con la Unión de anticuerpos sólidos. Cuanto mayor sea la cantidad de antígenos en la muestra, menor será el antígeno estándar enzimático unido a la fase sólida y menor será el color después de zui. Las hormonas de moléculas pequeñas, los medicamentos y otras pruebas Elisa se utilizan principalmente este método.

6. el paquete de captura se mide con anticuerpos

La detección de anticuerpos IgM se utiliza en el diagnóstico temprano de enfermedades infecciosas. El método indirecto Elisa generalmente solo es adecuado para detectar anticuerpos totales o igg. Por ejemplo, la determinación directa de anticuerpos IgM con el método indirecto del paquete de antígenos, debido a que generalmente hay concentraciones más altas de anticuerpos IgG simultáneamente en la muestra, este último competirá para unirse al antígeno de fase sólida, por lo que una parte de los anticuerpos IgM no se pueden unir a la fase sólida. Por lo tanto, si se utiliza IgM anti - humano como segundo anticuerpo para determinar indirectamente los anticuerpos igm, primero se debe tratar la muestra con proteína a o anticuerpos anti - IgG para eliminar la interferencia de igg. La mayoría de los anticuerpos IgM se determinan mediante el método de envoltura de captura en las pruebas clínicas. Los anticuerpos IgM humanos se envuelven primero en fase sólida para capturar IgM en muestras de suero (que incluyen anticuerpos IgM específicos para antígenos e IgM no específicos). Luego se añade el antígeno, que solo se une a IgM específico. A continuación, se agregan enzimas para etiquetar anticuerpos específicos contra antígenos. Después de actuar con el sustrato, el color está positivamente relacionado con el IgM en el espécimen. Este método se utiliza comúnmente en el diagnóstico temprano de infecciones virales. El patrón de detección de anticuerpos contra el virus de la hepatitis A (hav) se muestra en la figura 2 - 7. El factor reumatoide (rf) también puede interferir con la determinación de anticuerpos IgM por el método de encapsulamiento de captura, lo que resulta en una respuesta falsa positiva. Por lo tanto, el método indirecto de neutralización de IgG ha sido muy popular recientemente, y la detección de anticuerpos IgM anti - CMV e IgM anti - Toxoplasma gondii con este tipo de reactivos ha sido exitosa.

7. método ABS - ELISA

El ABS es la abreviatura del sistema de biotina de avidin. La avidina es una Glicoproteína con un peso molecular de 60.000 y cada molécula está compuesta por cuatro subunidades que pueden unirse a la biotina. La biotina es un compuesto Molecular pequeño con un peso molecular de 244. El derivado de la hidroxisuccinimida preparado por métodos químicos puede formar productos marcados con biotina con muchos tipos de moléculas grandes y pequeñas, como proteínas y azúcares, y el método de marcado es bastante simple. La Unión de biotina y avidina tiene una fuerte especificidad, su afinidad es mucho mayor que la respuesta de antígenos y anticuerpos, y una vez que se unen, los dos son extremadamente estables. Debido a que una avidina puede unirse a cuatro moléculas de biotina, por ejemplo, el método ABS y el método Elisa se pueden dividir en dos tipos: el método avidina - biotina marcado enzimático (lab) y el método avidina - biotina de puente (abc). Ambos reemplazan los anticuerpos marcados con enzimas (antígenos) del sistema Elisa original por anticuerpos (o antígenos) marcados con biotina. En lab, la biotina sólida reacciona primero con la avidina no marcada y luego agrega la biotina marcada por la enzima para mejorar aún más la sensibilidad. En las primeras etapas, la avidina se extrae de la clara de huevo, una Glicoproteína alcalina que tiene una fuerte adsorción con el vector de poliestireno y que se utiliza en Elisa para aumentar el fondo. La estreptomicina extraída de la estreptomicina no tiene esta desventaja y hay una tendencia a reemplazar la primera en aplicaciones de elisa. Debido a que el ABS - Elisa utiliza dos reactivos más que el Elisa ordinario, aumentando los pasos operativos, el ABS - Elisa no se aplica mucho en los ensayos clínicos.