Al cultivar células periféricas microvasculares humanas, la selección del medio de cultivo y los detalles de operación afectan directamente el Estado de crecimiento celular y la fiabilidad de los resultados experimentales. Las siguientes son instrucciones complementarias para varias precauciones clave:

1. calidad del suero y estabilidad del lote

Si se utilizan medios de cultivo que contienen suero (como el dmem del 10% de fbs), es necesario garantizar una fuente confiable de suero y evitar la contaminación por micoplasma o lps. Puede haber diferencias en los factores de crecimiento en los diferentes lotes de suero, por lo que se recomienda realizar pruebas por lotes con antelación o seleccionar medios libres de suero para reducir las variables.

2. estrategia complementaria del factor de crecimiento

Las células periféricas son sensibles a factores de crecimiento como pdgf - BB y bfgf, pero las concentraciones excesivas pueden causar proliferación excesiva o desviación de diferenciación. Se recomienda determinar la proporción óptima de adición a través de experimentos previos y reemplazar regularmente los medios recién preparados (preferiblemente cada 2 - 3 días).

3. regulación de la tensión del oxígeno

Las células periféricas microvasculares se encuentran en un microambiente hipóxico (1 - 5% oš) en el cuerpo, y las incubadoras convencionales (21% oš) pueden desencadenar estrés oxidativo. Se puede considerar el uso de incubadoras de tres gases para simular las condiciones fisiológicas de oxígeno o agregar antioxidantes para aliviar el daño hipóxico.

4. optimización de la cubierta del sustrato

Las paredes celulares dependen de las proteínas de la matriz y se recomienda el uso de paquetes de colágeno IV o fibronectina para la placa de petri, pero se debe prestar atención a la concentración del sobre (generalmente 5 - 10 μg / CM cuadrado). El sobre puede cambiar las características de migración celular.

5. prevención y control del riesgo de contaminación

Las células periféricas son vulnerables a la contaminación por fibroblastos y pueden identificar regularmente la pureza a través de la inmunofluorescencia cd146 o la tinción ng2. Si se encuentra contaminación, se puede probar el método de adhesión diferencial a la pared o la clasificación por flujo para la purificación.

6. refinamiento de la operación de generación en generación

Durante la digestión, se recomienda una baja concentración (0,05%) combinada con una incubación corta (2 - 3 minutos) y neutralizarla a tiempo con un medio de cultivo que contenga suero. La proporción de paso se controla de 1: 2 a 1: 3 para evitar el envejecimiento causado por la baja densidad de células de paso único.

7. precauciones para la Criopreservación y la recuperación

El liofilizado debe contener un 10% de Dmso y una alta concentración de suero (como un 90% de fbs), y el nitrógeno líquido debe conservarse después de que el procedimiento se enfríe. El cambio de líquido después de la reanimación debe completarse en 24 horas para eliminar el Dmso residual.

A través del control de los detalles anteriores, se puede mejorar significativamente la precisión de los datos de investigación repetitiva y funcional del cultivo de células periféricas. En experimentos posteriores como el cocultivo o la construcción de modelos de angiogénesis, se recomienda la detección simultánea de marcadores como alfa - SMA y desmoin para confirmar la estabilidad fenotípica celular.