Después de completar el aislamiento y cultivo de los fibrocitos de origen tisular del cáncer de esófago humano, es necesario identificar y analizar más a fondo la función de las células para garantizar que sus características biológicas cumplan con los requisitos experimentales. Los siguientes son los pasos clave de la operación de seguimiento:

1. observación morfológica celular

Observar regularmente la morfología celular con un microscopio invertido. Los fibrocitos primarios suelen tener forma de fusiforme o poliángulos, crecer pegado a la pared y el Citosol se estira bien. Si se presentan células flotantes redondas o aglomeraciones anormales, puede indicar contaminación o mal estado celular, por lo que es necesario reevaluar las condiciones de cultivo.

2. identificación por inmunofluorescencia

- Tinción inmunofluorescente por marcadores específicos (como vimentin, alfa - sma). Los fibrocitos deben expresar Vimentina en alto, mientras que la tasa positiva de alfa - SMA puede reflejar su grado de activación. Preste atención a establecer controles del mismo tipo para descartar combinaciones no específicas.

3. experimentos de verificación funcional

- prueba de la capacidad de proliferación: se evalúa la actividad proliferativa celular mediante el método cck - 8 o edu, y se comparan las diferencias entre los fibrocitos de origen precancerígeno y cancerígeno.

Análisis de la secreción de colágeno: la detección de los niveles de secreción de colágeno tipo I / III por Elisa o Western blot aclara su capacidad para promover la fibrosis.

- experimento de cocultivo: cocultivo de fibrocitos con líneas celulares de cáncer de esófago (como kyse - 150) para observar sus efectos sobre la invasión y migración de células cancerosas (como el experimento transwell).

4. Criopreservación y recuperación

- se seleccionan células de crecimiento logarítmico, se empaquetan en un criodepósito con un 10% de Dmso y se transfieren al nitrógeno líquido después de un enfriamiento programático. El baño de agua se derrite rápidamente durante la reanimación, se centrifuga para eliminar el congelador, se suspende en un medio de cultivo de suero de alta concentración y se cambia el líquido 24 horas después.

Precauciones

- Operaciones estrictamente estériles para evitar la contaminación por micoplasma;

Se recomienda que el número de generaciones de células primarias no supere las 5 generaciones para evitar la deriva fenotípica;

Los experimentos funcionales deben repetirse más de tres veces para garantizar la fiabilidad de los datos.