Para optimizar la eficiencia de detección de la PCR convencional, además de optimizar el sistema de reacción y el diseño de los primeros, también es necesario prestar atención al ajuste refinado del procedimiento de amplificación. Estas son algunas estrategias clave:

1. la PCR gradiente determina la temperatura óptima de recocido
La temperatura de recocido es crucial para la especificidad de la amplificación. La temperatura de recocido se puede seleccionar rápidamente a través de la PCR de gradiente (por ejemplo, estableciendo un gradiente de 50 ° C - 65 ° c) para evitar bandas no específicas o fallos de amplificación. Si el valor de la Tm del primer es muy diferente, se puede probar "touchdown pcr", es decir, reducir gradualmente la temperatura de recocido desde una temperatura más alta, dando prioridad a la amplificación de productos altamente específicos.

2. optimizar los parámetros del ciclo
- tiempo de predisposición: para plantillas con alto contenido de gc, la degeneración inicial se puede extender a 5 - 10 minutos, asegurando la resolución de la cadena de adn.
- tiempo de extensión: ajustado en función de la longitud del fragmento amplificado (generalmente calculado en 1 kb / min), pero se debe prestar atención a las diferencias en la actividad enzimática. Por ejemplo, las enzimas de alta fidelidad pueden tardar más.
- número de ciclos: se recomienda un ciclo de 25 - 35 para la amplificación convencional. El exceso de circulación aumenta el riesgo de dimer de primer, que puede equilibrar la sensibilidad y la especificidad diluyendo la plantilla o reduciendo el número de ciclos.

3. uso de aditivos
- Dmso o betaína: alivia los efectos de estructuras secundarias complejas y es especialmente adecuado para fragmentos largos o plantillas de alta GC (concentración final recomendada del 3 - 5%).
- Optimización de la concentración de mg cuadrados: mg cuadrados es un Cofactor de la enzima Taq y su concentración (generalmente 1,5 - 2,5 mm) debe equilibrarse con los dntps. La concentración óptima se puede determinar mediante experimentos de gradiente con intervalos de 0,5 mm.

4. calidad y cantidad de la plantilla
Evite usar plantillas degradadas o que contengan inhibidores. Si la muestra es ADN ambiental, se pueden aumentar los pasos de pretratamiento (como la purificación de la columna). El número de plantillas se recomienda entre 1 - 100 ng, y demasiado puede conducir a una amplificación no específica, y demasiado poco puede requerir un aumento del número de ciclos.

5. configuración de comparación
Se incluyen controles positivos (plantillas conocidas), controles negativos (sin plantillas) y controles internos (como el gen del mayordomo) para descartar la contaminación del reactivo o anomalías del sistema.